К первичным метаболитам относятся. Биотехнология производства вторичных метаболитов

Из всех продуктов, получаемых с помощью микробных процессов, наибольшее значение имеют вторичные метаболиты. Вторичные метаболиты, называемые также идиолитами, это низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре. Они производятся ограниченным числом таксономических групп и часто представляют собой смесь близкородственных соединений, относящихся к одной и той же химической группе. Если вопрос о физиологической роли вторичных метаболитов в клетках-продуцентах был предметом серьезных дискуссий, то их промышленное получение представляет несомненный интерес, так как эти метаболиты являются биологически активными веществами: одни из них обладают антимикробной активностью, другие являются специфическими ингибиторами ферментов, третьи - ростовыми факторами, многие обладают фармакологической активностью. К вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины. Фармацевтическая промышленность разработала сверхсложные методы скрининга (массовой проверки) микроорганизмов на способность продуцировать ценные вторичные метаболиты.

Получение такого рода веществ послужило основой для создания целого ряда отраслей микробиологической промышленности. Первым в этом ряду стало производство пенициллина; микробиологический способ получения пенициллина был разработан в 1940-х годах и заложил фундамент современной промышленной биотехнологии.

Молекулы антибиотиков очень разнообразны по составу и механизму действия на микробную клетку. При этом в связи с возникновением устойчивости патогенных микроорганизмов к старым антибиотикам постоянно существует потребность в новых. В некоторых случаях природные микробные антибиотические продукты химическим или энзиматическим путем могут быть превращены в так называемые полусинтетические антибиотики, обладающие более высокими терапевтическими свойствами.

Антибиотики -- органические соединения. Они синтезируются живой клеткой и способны в небольших концентрациях замедлить развитие или полностью уничтожить чувствительные к ним виды микроорганизмов. Их продуцируют не только клетки микроорганизмов и растений, но и клетки животных. Антибиотики растительного происхождения называют фитонцидами. Это хлорелин, томатин, сативин, получаемый из чеснока, и алин, выделяемый из лука.

Рост микроорганизмов можно охарактеризовать как S - образную кривую. Первая стадия - стадия быстрого роста, или логарифмическая, для которой характерен синтез первичных метаболитов. Далее наступает фаза медленного роста, когда увеличение биомассы клеток резко замедляется. Микроорганизмы, производящие вторичные метаболиты, вначале проходят стадию быстрого роста, тропофазу, во время которой синтез вторичных веществ незначителен. По мере замедления роста из-за истощения одного или нескольких необходимых питательных веществ в культуральной среде микроорганизм переходит в идиофазу; именно в этот период синтезируются идиолиты. Идиолиты, или вторичные метаболиты, не играют явной роли в процессах метаболизма, они вырабатываются клетками для адаптации к условиям окружающей среды, например, для защиты. Их синтезируют не все микроорганизмы, а в основном нитчатые бактерии, грибы и спорообразующие бактерии. Таким образом, продуценты первичных и вторичных метаболитов относятся к разным таксономическим группам.

Особенности культурального роста этих микроорганизмов необходимо учитывать при производстве. Например, в случае антибиотиков большинство микроорганизмов в процессе тропофазы чувствительно к собственным антибиотикам, однако во время идиофазы они становятся к ним устойчивыми.

Большинство пряностей, приправ, чая и других напитков, таких как кофе и какао обязаны их индивидуальным свойствам (вкусу и аромату) фармакологически активным вторичным метаболитам растений, которые их содержат. Хотя некоторые из этих активных веществ (например, ванилин, эфедрин и кофеин) получают путем полу или полного синтеза, высокие цены по-прежнему выплачиваются в для соединений, выделенных из природных источников, особенно если они предназначены для использования в качестве пищевых добавок и ароматизаторов.

Некоторые биологически активные вторичные метаболиты нашли применение как наркотики или в качестве модельных соединений для синтеза наркотиков и semisyntheses. Однако, часто забывают, что натуральные продукты часто служат химическим моделям для проектирования и полного синтеза новых структур наркотиков. Например, меперидин (демерол), пентазоцин (Talwin) и пропоксифен (Darvon) являются полностью синтетическими анальгетиками для которых опиаты, такие как морфин и кодеин, были моделями, в то время как аспирин является простой производной салициловой кислоты, первоначально полученные из ивы (Salix SPP.).

По сравнению с относительно низкой стоимостью первичных и массовых метаболитов, вторичные метаболиты растений часто оцениваются от нескольких долларов до нескольких тысяч долларов за килограмм. Например, очищенные алкалоиды опия (кодеин и морфин) оцениваются в диапазоне от $ 650 до $ 1250 за килограмм, а редкие летучие (эфирные) масла, например, розовое масло, часто на сумму более $ 2000 до $ 3000 за килограмм. Противоопухолевые алкалоиды Катарантуса имеют оптовую стоимость около $ 5000 за грамм, а их розничная стоимость может достигать $ 20,000 за грамм. Натуральные продукты часто имеют весьма сложные структуры с множеством хиральных центров, которые могут определить биологическую активность. Такие сложные соединения не могут быть синтезированы искусственно. Хорошим примером такого метаболита с высокой степенью структурной сложности является естественный азадирахтин растительный инсектицидам.

Экономически важные характеристики первичных и вторичных метаболитов. Большинство из них может быть получено из растительного сырья путем дистилляции паром или экстракцией органическими растворителями, и (за исключением биополимеров, натурального каучука, конденсированных танинов и веществ с высоким молекулярным весом, полисахариды, такие как десны, пектин и крахмал), у них, как правило, относительно низкая молекулярная масса (как правило, менее чем 2000).

К экономически важным веществам растительного происхождения относятся ферменты папаин и chymopapain (ферменты, полученные из папайи (Carica Papaya), которые используются в лечебных целях, бромелайн (переваривание белков молока и свертывания фермента из ананасового сока) и экстракт солода (продукт из ячменя, который содержит расщепляющий крахмал фермент).

Получение и использование специальных растительных белков из растительных клеток имеет ограниченное значение по нескольким причинам. Во-первых, их химическая структура накладывает определенные ограничения на их использование в качестве биологически активных соединений, которые могут выступать, как наркотики и пестициды. Например, большинство белков не может быть легко, поглощаться через кожу млекопитающих или экзоскелета насекомых, и большинство из них также не могут быть введены в пероральной форме (кроме как для достижения местного эффекта), поскольку они подвержены деградации пищеварительными протеолитическими ферментами. Для воспроизводимых системных эффектов, вызванных, полипептидами (таких, как chymopapain) должны вводиться в виде инъекций. Таким образом, белки не являются биологически доступными также легко, как вторичные метаболиты (белковые продукты), что осложняет разработку из них конечных продуктов и их использование. Например, некоторые потенциально полезные белки могут быстро деградировать из-за физико-химической неустойчивости. В настоящее время уже имеются технологии для вставки и выражение у бактерий и дрожжей генов, кодирующих синтез ценных полипептидов. Однако, и в данном случае возникают трудности для производства сложных вторичных метаболитов в связи из-за характера вторичного биосинтеза метаболитов в растениях. Белки являются непосредственными продуктами генов, тогда как вторичные метаболиты, как правило, синтезированы с помощью совместных действий многих генных продуктов (ферменты) (Y. Aharonowitz). Генов, ответственных за биосинтез экономически важных вторичных метаболитов очень много (для каждого биосинтетического пути, ведущих к производству вторичного метаболита, требуются многие гены). Кроме того, генномодифицированные микроорганизмы имеют множество ферментов в своем пути биосинтеза, которые могут катализировать нежелательные побочные реакции с желаемым метаболитом или полупродуктом. Таким образом, по крайней мере, в ближайшем будущем, растения или растительные клетки, вероятно, будут выступать в качестве источников для большинства биологически активных растительных компонентов.

Ряд метаболитов клетки представляют интерес как целевые продукты ферментации. Их разделяют на первичные и вторичные.

Первичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения (молекулярная масса менее 1500 дальтон), необходимые для роста микроорганизмов. Одни из них являются строительными блоками макромолекул, другие участвуют в синтезе коферментов. Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, нуклеотиды, витамины и др.

Биосинтез первичных метаболитов осуществляют различные биологические агенты – микроорганизмы, растительные и животные клетки. При этом используются не только природные организмы, но и специально полученные мутанты. Чтобы обеспечить высокие концентрации продукта на стадии ферментации, необходимо создавать продуценты, противостоящие генетически свойственным их природному виду механизмам регуляции. Например, необходимо устранить накопление конечного продукта, репрессирующего или ингибирующего важный фермент для получения целевого вещества.

Производство аминокислот.

В процессе ферментаций, осуществляемых ауксотрофами (микроорганизмы, нуждающиеся для воспроизведения в факторах роста), производят многие аминокислоты и нуклеотиды. Распространенными объектами селекции продуцентов аминокислот являются микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Arthrobacter.

Из 20 аминокислот, составляющих белки, восемь не могут синтезироваться в организме человека (незаменимые). Эти аминокислоты должны поступать в организм человека с пищей. Среди них особенное значение имеют метионин и лизин. Метионин производится химическим синтезом, а более 80% лизина – биосинтезом. Перспективным является микробиологический синтез аминокислот, так как в результате этого процесса получаются биологически активные изомеры (L-аминокислоты), а при химическом синтезе оба изомера получаются в равных количествах. Поскольку их трудно разделить, половина продукции оказывается биологически бесполезной.

Аминокислоты используют в качестве пищевых добавок, приправ, усилителей вкуса, а также как сырье в химической, парфюмерной и фармацевтической промышленности.

Разработка технологической схемы получения отдельной аминокислоты базируется на знании путей и механизмов регуляции биосинтеза конкретной аминокислоты. Необходимого дисбаланса метаболизма, обеспечивающего сверхсинтез целевого продукта, добиваются путем строго контролируемых изменений состава и условий среды. Для культивирования штаммов микроорганизмов при производстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы – глюкоза, сахароза, фруктоза, мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды используют вторичное сырье: свекловичную мелассу, молочную сыворотку, гидролизаты крахмала. Технология этого процесса совершенствуется в направлении разработки дешевых синтетических питательных сред на основе уксусной кислоты, метанола, этанола, н -парафинов.

Производство органических кислот.

В настоящее время биотехнологическими способами в промышленных масштабах синтезируют ряд органических кислот. Из них лимонную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовую кислоты получают лишь микробиологическим способом; молочную, салициловую и уксусную – как химическим, так и микробиологическим способами; яблочную – химическим и энзиматическим путем.

Уксусная кислота имеет наиболее важное значение среди всех органических кислот. Ее используют при выработке многих химических веществ, включая каучук, пластмассы, волокна, инсектициды, фармацевтические препараты. Микробиологический способ получения уксусной кислоты состоит в окислении этанола в уксусную кислоту при участии бактерий штаммов Gluconobacter иAcetobacter:

Лимонную кислоту широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности, применяют для очистки металлов. Самый крупный производитель лимонной кислоты – США. Производство лимонной кислоты является старейшим промышленным микробиологическим процессом (1893 г.). Для ее производства используют культуру гриба Aspergillus niger, A. wentii . Питательные среды для культивирования продуцентов лимонной кислоты в качестве источника углерода содержат дешевое углеводное сырье: мелассу, крахмал, глюкозный сироп.

Молочная кислота – первая из органических кислот, которую начали производить путем брожения. Ее используют в качестве окислителя в пищевой промышленности, как протраву в текстильной промышленности, а также при производстве пластмасс. Микробиологическим путем молочную кислоту получают при сбраживании глюкозы Lactobacillus delbrueckii .

Диауксия - появление одной или нескольких переходных (т. е. временных) фаз роста в культуре. Это происходит, когда бактерии находятся в среде, содержащей два или более альтернативных источника питания. Часто бактерии используют один источник, предпочитая его другому, пока этот первый не истощится. Тогда бактерии переключаются на другой источник питания. Однако рост заметно замедляется еще до того, как произошла смена источника питания. Примером является Е. coli - бактерия, обычно обитающая в кишечнике. В качестве источника энергии и углерода она может использовать глюкозу или лактозу. Если присутствуют оба углевода, то вначале используется глюкоза, а затем рост замедляется до тех пор, пока не образуются ферменты, сбраживающие лактозу.

Образование первичных и вторичных метаболитов

Первичные метаболиты - это продукты метаболизма, необходимые для роста и выживания.
Вторичные метаболиты - продукты метаболизма, которые не требуются для роста и не существенны для выживания. Тем не менее они выполняют полезные функции и часто защищают от действия других конкурирующих микроорганизмов либо подавляют их рост. Некоторые из них токсичны для животных, поэтому они могут использоваться в качестве химического оружия. В наиболее активные периоды роста чаще всего они не образуются, но начинают производиться при замедлении роста, когда становятся доступными резервные материалы. Вторичными метаболитами являются некоторые важные антибиотики.

Измерение роста бактерий и грибов в культуре

В предыдущем разделе мы проанализировали типичную кривую роста бактерий . Можно ожидать, что такая же кривая характеризует рост дрожжей (одноклеточных грибов) или рост любой культуры микроорганизмов.

При анализе роста бактерий или дрожжей мы можем либо непосредственно подсчитывать число клеток, либо измерять некоторые параметры, зависимые от числа клеток, например мутность раствора или выделение газа. Обычно небольшое количество микроорганизмов засевают в стерильную питательную среду и выращивают культуру в инкубаторе при оптимальной температуре роста. Остальные условия должны быть как можно более близкими к оптимальным (разд. 12.1). Рост следует измерять от момента инокуляции.

Обычно в научных исследованиях придерживаются хорошего правила - проводить эксперимент в нескольких повторах и ставить контрольные пробы, где это можно и нужно. Некоторые методики измерения роста требуют определенного навыка и даже в руках специалистов они не очень точны. Поэтому имеет смысл ставить, если возможно, две пробы (один повтор) в каждом эксперименте. Контрольная проба, в которой к питательной среде не добавляли микроорганизмы, покажет, действительно ли вы работаете стерильно. Имея достаточный опыт, можно в совершенстве овладеть всеми описанными методами, поэтому мы советуем сначала попрактиковаться в них, прежде чем они будут использованы в работе над проектом. Определить число клеток можно двумя способами, а именно, подсчитывая либо число жизнеспособных клеток, либо общее число клеток. Число жизнеспособных клеток - это число только живых клеток. Общее число клеток - это суммарное число как живых, так и мертвых клеток; обычно этот показатель определить легче.

A. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

С точки зрения биогенеза антибиотики рассматривают как вторичные метаболиты. Вторичные метаболиты - это низкомолекулярные природные продукты, которые 1) синтезируются только некоторыми видами микроорганизмов; 2) не выполняют каких-либо явных функций при росте клеток и часто образуются после прекращения роста культуры; клетки, синтезирующие эти вещества, легко утрачивают способность к синтезу в результате мутаций; 3) часто образуются в виде комплексов сходных продуктов.

Первичные метаболиты - нормальные продукты обмена клетки, такие как аминокислоты, нуклеотиды, коферменты и т. д., необходимые для роста клеток.

Б. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ПЕРВИЧНЫМ

И ВТОРИЧНЫМ МЕТАБОЛИЗМОМ

Изучение биосинтеза антибиотиков состоит в установлении последовательности ферментативных реакций, в ходе которых один или несколько первичных метаболитов (или промежуточных продуктов их биосинтеза) превращаются в антибиотик. Необходимо помнить о том, что образование вторичных метаболитов, особенно в больших количествах, сопровождается значительными изменениями в первичном метаболизме клетки, поскольку при этом клетка должна синтезировать исходный материал, поставлять энергию, например в форме АТР, и восстановленные коферменты. Неудивительно поэтому, что при сравнении штаммов, синтезирующих антибиотики, со штаммами, не способными к их синтезу, обнаруживаются значительные различия в концентрации ферментов, которые прямо не участвуют в синтезе данного антибиотика.

B. ОСНОВНЫЕ БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПУТИ

Ферментативные реакции биосинтеза антибиотиков в принципе не отличаются от реакций, в ходе которых образуются первичные метаболиты. Их можно рассматривать как вариа

ции реакций биосинтеза первичных метаболитов, конечно, за некоторыми исключениями (например, есть антибиотики, содержащие нитрогруппу - функциональную группу, которая никогда не встречается у первичных метаболитов и которая образуется при специфическом окислении аминов).

Механизмы биосинтеза антибиотиков можно разделить на три основные категории.

1. Антибиотики, происходящие от единственного первичного метаболита. Путь их биосинтеза состоит из последовательности реакций, модифицирующих исходный продукт таким же образом, как и при синтезе аминокислот или нуклеотидов.

2. Антибиотики, происходящие от двух или трех разных первичных метаболитов, которые модифицируются и конденсируются с образованием сложной молекулы. Аналогичные случаи наблюдаются и в первичном метаболизме при синтезе некоторых коферментов, например фолиевой кислоты или кофермен- та А.

3. Антибиотики, берущие начало от продуктов полимеризации нескольких сходных метаболитов с образованием основной структуры, которая в дальнейшем может модифицироваться в ходе других ферментативных реакций.

В результате полимеризации образуются антибиотики четырех типов: 1) полипептидные антибиотики, образующиеся путем конденсации аминокислот; 2) антибиотики, образованные из ацетат-пропионатных единиц в реакциях полимеризации, сходных с реакцией биосинтеза жирных кислот; 3) терпеноидные антибиотики, происходящие из ацетатных единиц в пути синтеза изопреноидных соединений; 4) аминогликозидные антибиотики, образующиеся в реакциях конденсации, сходных с реакциями биосинтеза полисахаридов.

Эти процессы сходны с процессами полимеризации, обеспечивающими образование некоторых компонентов мембраны и клеточной стенки.

Необходимо подчеркнуть, что основная структура, полученная путем полимеризации, далее обычно модифицируется; к ней даже могут присоединиться молекулы, образующиеся с помощью других биосинтетических путей. Особенно часто встречаются гликозидные антибиотики - продукты конденсации одного или нескольких сахаров с молекулой, синтезированной в пути 2.

Г. СИНТЕЗ аСЕМЕЙСТВ» АНТИБИОТИКОВ

Часто штаммы микроорганизмов синтезируют несколько близких в химическом и биологическом отношении антибиотиков, составляющих «семейство» (антибиотический комплекс). Образование «семейств» характерно не только для биосинтеза

Антибиотиков, а является общим свойством вторичного метаболизма, связанным с довольно большим" размером промежуточных продуктов. Биосинтез комплексов родственных соединений осуществляется в ходе следующих метаболических путей.

1. Биосинтез «ключевого» метаболита в одном из путей, описанных в предыдущем разделе.

Рифамицин У

окисл.

Рис. 6.1. Пример метаболического дерева: биосинтез рифамицина (объяснения см. в тексте; структурные формулы соответствующих соединений приведены на рис. 6.17 и 6.23).

2. Модификация ключевого метаболита с помощью довольно распространенных реакций, например путем окисления метальной группы в спиртовую и далее в карбоксильную, восстановления двойных связей, дегидрирования, метилирования, этерификации и т. д.

3. Один и тот же метаболит может быть субстратом двух или нескольких таких реакций, приводящих к образованию двух или большего числа различных продуктов, которые в свою очередь могут подвергаться различным превращениям с участием ферментов, давая начало «метаболическому дереву».

4. Один и тот же метаболит может образовываться в двух (или более) различных путях, в которых изменяется только
порядок ферментных реакций, давая начало «метаболической сети».

Довольно своеобразные концепции метаболического дерева и метаболической сети можно пояснить следующими примерами: биогенез семейства рифамицинов (дерево) и эритромицинов (сеть). Первым метаболитом при биогенезе семейства рифамицинов является проторифамицин I (рис. 6.1), который можно рассматривать как ключевой метаболит. В последовательности

реакций, порядок которых неизвестен, проторифамицин I превращается в рифамицин W и рифамицин S, завершая часть синтеза с использованием единственного пути («ствол» дерева). Рифамицин S является начальной точкой разветвления нескольких альтернативных путей: конденсация с двууглеродным фрагментом дает начало рифамицину О и рафимицинам L и В. Последний в результате окисления анза-цепи превращается в рифамицин Y. Отщепление одноуглеродного фрагмента при окислении рифамицина S ведет к образованию рифамици- на G, а в результате неизвестных реакций рифамицин S превращается в так называемый рифамициновый комплекс (рифа- мицины А, С, D и Е). Окисление метальной группы при С-30 дает начало рифамицину R.

Ключевым метаболитом семейства эритромицина является эритронолид В (Эр.В), который превращается в эритромицинА (наиболее сложный метаболит) с помощью следующих четырех реакций (рис. 6.2): 1) гликозилирование по положению 3 пу

тем конденсации с микарозой (Мик.) (реакция I); 2) превращение микарозы в кладинозу (Клад.) в результате метилирования (реакция II); 3) превращение эритронолида В в эри- тронолид А (Эр.А) в результате гидроксилирования по положению 12 (реакция III); 4) конденсация с дезозамином (Дез.) в положении 5 (реакция IV).

Поскольку порядок этих четырех реакций может варьировать, возможны различные метаболические пути, а вместе взятые они составляют метаболическую сеть, представленную на рис. 6.2. Нужно отметить, что имеются также пути, которые представляют собой комбинацию дерева и сети.

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ ИМПЕРАТОРА ПЕТРА I»

Кафедра ботаники, защиты растений, биохимии и микробиологии

Курсовая работа

по биохимии растений

Тема: Вторичные метаболиты

Выполнила: студентка ТТ-2-1б

Калинина Яна Геннадьевна

Проверил: доцент

Мараева Ольга Борисовна

ВОРОНЕЖ 2013

Введение

Метаболиты вторичные - соединения, часто сложного состава, не являющиеся основными промежуточными соединениями метаболизма клетки, образуются в его тупиковых ветвях. Метаболиты вторичные растений являются, например, алкалоиды. Микроорганизмы образуют вторичные метаболиты, как правило, в период замедления или прекращения активного роста и размножения культур. В качестве вторичных метаболитов микроорганизмы образуют некоторые пигменты, антибиотики, витамины. Большое значение имеет синтез вторичных метаболитов микроорганизмами в процессе формирования гумуса почвы.

Каким бы путем ни осуществлялся фотосинтез, в конечном итоге он завершается накоплением энергетически богатых запасных веществ, составляющих основу для поддержания жизнедеятельности клетки и в конечном итоге всего многоклеточного организма. Эти вещества являются продуктами первичного метаболизма. Помимо главнейшей своей функции первичные метаболиты - основа для биосинтеза соединений, которые принято называть продуктами вторичного метаболизма. Последние, часто называемые условно "вторичными метаболитами", целиком "обязаны" своим существованием в природе продуктам, образующимся в итоге фотосинтеза. Следует заметить, что синтез вторичных метаболитов осуществляется за счет энергии, освобождающейся в митохондриях в процессе клеточного дыхания.

1. Обзор литературы

1.1 Признаки вторичных метаболитов

По химической структуре молекулы отличить вторичные метаболиты от первичных можно далеко не всегда. На рис. 1 приведены некоторые примеры первичных и вторичных метаболитов.

Рис. 1. Структуры кампестерина (первичный метаболит), экдизона и протопанаксатриола (вторичные метаболиты)

Фитостерины (ситостерин, кампестерин, стигмастерин) - обязательные компоненты мембран растительной клетки, и, следовательно, - типичные первичные соединения. Экдистероиды (гормоны линьки насекомых) - вторичные метаболиты, они присутствуют лишь у некоторых видов растений. Эти вещества, как полагают, участвуют в защите растений от насекомых. Протопанаксатриол является агликоном гинзенозидов - вторичных метаболитов женьшеня, присутствующих только в роде Рапах и в большой степени отвечающих за его биологическую активность. В то же время структуры молекул этих соединений похожи и отличаются только числом и расположением метальных и гидроксильных групп. Структуры белковых аминокислот (первичные метаболиты) и небелковых аминокислот (типичные вторичные метаболиты) часто отличаются лишь наличием или отсутствием метильной, гидроксильной либо другой функциональной группы.

На основе анализа литературы можно сформулировать четыре признака вторичных метаболитов:

) присутствие не во всех растениях;

) наличие биологической активности;

) относительно низкий молекулярный вес;

) небольшой набор исходных соединений для их синтеза.

Это именно признаки вторичных метаболитов, поскольку каждый из них, в общем-то, не обязателен. Ряд вторичных метаболитов найден практически во всех растениях (например, многие фенилпропаноиды); достаточно много вторичных метаболитов без выраженной биологической активности (хотя не исключен вариант, что ее просто не обнаружили); известны высокомолекулярные вторичные метаболиты (например, каучук и гуттаперча). Однако совокупность указанных признаков достаточно четко очерчивает крут вторичных метаболитов растений.

Наиболее обоснованно отнести соединение к первичным или вторичным метаболитам можно только после выяснения его роли в жизнедеятельности растения, т.е. на основе его функциональной значимости. Функциональное определение вторичного метаболизма в первом приближении можно дать как метаболизм соединений, имеющих значение на уровне клетки.

1.2 Принципы классификации вторичных метаболитов

Принципы классификации вторичных метаболитов, как и названия индивидуальных соединений, изменялись по мере их изучения. Сейчас можно встретить элементы по крайней мере четырех вариантов классификации.

Эмпирическая (тривиальная) классификация. Самый «древний» принцип классификации, основанный на определенных свойствах вторичных метаболитов. Например, алкалоиды - соединения, имеющие щелочные свойства; сапонины - вещества, образующие при встряхивании пену; горечи - соединения с горьким вкусом; эфирные масла - ароматные летучие вторичные метаболиты. Подобный принцип классификации имеет много недостатков, однако его элементы встречаются до сих пор в силу традиции и длительного употребления.

Вторичные метаболиты получали (и получают) свои названия, как правило, также эмпирически. Чаще всего названия происходят от растения, из которого впервые было выделено соединение. Например, алкалоиды папаверин (мак), берберин (барбарис), кокаин (кокаиновый куст). Довольно часто названия связаны с мифологией, историей, личностями и т.д. Например, алкалоид морфин получил свое название в честь бога сна. Подобный способ классификации и формирования названий соединений часто приводит к недоразумениям. Например, биологически активные тритерпеновые гликозиды женьшеня практически одновременно начали изучать в Японии и в России. Японские исследователи предложили их называть гинзенозидами - по видовому названию женьшеня, тогда как русские исследователи - панаксозидами, т.е. по родовому названию. Позже, когда стало ясно, что одни и те же соединения называются по-разному, пришлось публиковать «таблицы соответствия» гинзенозидов и панаксозидов.

Химическая классификация. Этот вариант классификации основан на признаках химической структуры вторичных метаболитов и на данный момент времени наиболее разработан и распространен. Однако и эта классификация не лишена недостатков. Например, алкалоиды по такой классификации - соединения, имеющие атом азота в гетероцикле. По этому признаку гликоалка-лоиды картофеля или томатов - типичные алкалоиды, однако по способу синтеза, структуре и ряду свойств эти соединения являются изопреноидами.

Биохимическая классификация. Эта классификация базируется на способах биосинтеза вторичных метаболитов. Например, согласно этой классификации упомянутые выше гликоалкалоиды относятся к тритерпеновым псевдоалкалоидам, так как синтезируются, как и стероидные гликозиды, по изопреноидному пути. Это, по-видимому, наиболее объективный вариант классификации. Однако поскольку биохимия вторичного метаболизма еще недостаточно разработана, такая классификация находится в периоде становления.

Функциональная классификация. Основана на функциях вторичных метаболитов в интактном растении. Этот вариант принципиально отличается от предыдущих и должен существовать параллельно с ними. Согласно функциональной классификации в одну группу соединений могут попадать химически разные структуры. Например, фитоалексины (вторичные метаболиты, имеющие защитные функции и синтезирующиеся в ответ на атаку патогена) представлены в разных видах фенольными соединениями, изопреноидами, полиацетиленами и др. Разработка функциональной классификации вторичных метаболитов только начинается, но она имеет принципиальное значение для физиологии растений.

Наличие разных вариантов классификации вторичных метаболитов приводит к определенным сложностям. В частности, при использовании разных признаков, используемых при химической классификации, возможно «перекрытие» групп вторичных метаболитов. Например, в «фармакогнозии» в качестве действующих веществ многих лекарственных растений выделяют гликозиды (соединения, молекула которых состоит из агликона и углеводного фрагмента) в отдельную группу. В то же время по структуре агликона эти гликозиды могут быть отнесены к фенольным соединениям, изопреноидам или другим группам вторичных метаболитов. Еще больше проблем возникает, когда соединение содержит ряд признаков, характерных для разных групп вторичных метаболитов (например, пренилированные фенольные соединения). В ряде случаев появляющиеся проблемы можно снять, корректируя химическую классификацию биохимической.

1.3 Основные группы вторичных метаболитов

В настоящее время известно более десятка групп (классов) вторичных метаболитов. При этом некоторые группы насчитывают по несколько тысяч индивидуальных соединений, тогда как другие - лишь единицы. Так же неравномерно распределены группы в растительном мире. Например, изопреноиды и фенольные соединения присутствуют во всех видах растений, тогда как некоторые группы (например, тиофены или ацетогенины) характерны лишь для единичных видов.

Хорошо известны три самые большие группы вторичных метаболитов - алкалоиды, изопреноиды (терпеноиды) и фенольные соединения. Каждая из этих групп состоит из несколько тысяч соединений и подразделяется на многочисленные подгруппы. Известно также около десятка менее многочисленных групп вторичных метаболитов: растительные амины, небелковые аминокислоты, цианогенные гликозиды, глюкозинолаты, полиацетилены, беталаины, алкиламиды, тиофены и др. Количество соединений, входящих в эти группы, колеблется от единиц до нескольких сотен.

Вторичные метаболиты в растении практически никогда не присутствуют в «чистом виде», они, как правило, входят в состав сложных смесей. Такие смеси в зависимости от их состава и нахождения в растении часто носят собственные, исторически сложившиеся названия.

Эфирные масла, как правило, представляют из себя смесь легко испаряющихся изопреноидов (моно- и сесквитерпенов).

Смолы представлены главным образом дитерпенами.

Камеди состоят преимущественно из полисахаридов, но в их состав часто входят алкалоиды, фенольные соединения.

Слизи - это смесь водорастворимых олиго- и полисахаридов, Сахаров, а также небольших количеств фенольных соединений, алкалоидов или изопреноидов.

1.4 Закономерности строения вторичных метаболитов

При анализе структур вторичных метаболитов создается впечатление, что их огромное разнообразие происходит по определенной схеме. Как правило, имеется определенная «базовая» структура, на основе которой образуются многочисленные варианты. При этом можно отметить несколько способов возникновения таких вариантов.

Модификации базовой структуры: обычно это либо присоединение, либо замена функциональных групп, изменение степени окисленности молекулы; в качестве функциональных групп часто используются гидроксильные, метильные либо метоксильные группы.

Образование конъюгатов: присоединение к базовой структуре «унифицированных блоков»; чаще всего различных сахаров (моно- или олигосахариды), органических кислот или некоторых групп вторичных метаболитов.

Конденсация: объединение нескольких одинаковых или различных базовых структур, например образование пренилированных фенольных соединений или димерных индольных алкалоидов.

Для разных групп вторичных метаболитов характерны специфические изменения структуры. Например, для алкалоидов характерно метоксилирование, но не гликозилирование; для изопреоидов, наоборот, типично гликозилирование, но не метоксилирование; у фенольных соединений наблюдаются оба типа этих модификаций.

Определенные модификации молекул, по-видимому, имеют существенное функциональное значение. Многие из них (в частности, гликозилирование) значительно изменяют биологическую активность молекулы. Очень часто гликозилирование является универсальным способом перевода активной (функциональной) формы вторичного метаболита в неактивную (запасную). По этой причине, видимо, нецелесообразно выделять все гликозиды в отдельную группу вторичных метаболитов.

1.5. Фитохимия вторичного метаболизма

Алкалоиды. Название этой группы веществ происходит от арабского alcali - щелочь и греческого eidos - подобный. В настоящее время известно около 10 000 индивидуальных алкалоидов.

В случае алкалоидов достаточно удачно совпали эмпирическая и химическая классификация. Согласно химической классификации, алкалоиды - это соединения, содержащие один или несколько атомов азота в молекуле, что и придает им щелочные свойства. По химической структуре алкалоиды обычно разделяют на две подгруппы: протоалкалоиды, которые содержат азот не в гетероцикле, и истинные алкалоиды, содержащие азот в гетероцикле. В распределение алкалоидов на подгруппы внесла коррективы биохимическая классификация. Гликоалкалоиды, а также ряд других алкалоидов (например, алкалоиды аконита) по типу синтеза и по структуре фактически являются изопреноидами. Поэтому было решено выделить их в особую группу - изопреноидных псевдоалкалоидов.

Наиболее широко алкалоиды распространены среди покрытосеменных растений. Особенно богаты ими семейства маковых, пасленовых, бобовых, кутровых, мареновых, лютиковых. Во мхах, папоротниках, голосеменных алкалоиды встречаются относительно редко.

Разные органы и ткани растения могут содержать разные алкалоиды. Обычно их концентрация невелика и составляет десятые и сотые доли процента. При содержании алкалоидов около 1 - 3 % растение считается богатым алкалоидами (алкалоидоносным). Только немногие растения, например культивируемые формы хинного дерева, могут накапливать до 15 - 20% алкалоидов. Протоалкалоиды встречаются довольно часто в растениях разных семейств, но, как правило, не накапливаются в значительных количествах.

Алкалоиды накапливаются, как правило, в вакуолях, а в периплазматическое пространство практически не поступают. Возможно, это является следствием «бережного отношения» растения к азотсодержащим соединениям. Транспорт алкалоидов в вакуоли проходит с участием специфичных переносчиков (видимо, ABC-транспортеров). Во всяком случае в изолированные вакуоли эффективно поступают только «собственные» алкалоиды, т.е. характерные для данного растения. В вакуолях алкалоиды обычно находятся в виде солей. Синтез алкалоидов проходит преимущественно в пластидах, либо в цитозоле.

Рис. 2. Структуры некоторых алкалоидов

Изопреноиды - обширная группа соединений, имеющих общую формулу (С5Н8)n. С5Н8 - это единица изопрена, таким образом изопреноиды являются соединениями, «составленными» из нескольких изопреновых единиц. Их биосинтез действительно идет соединением пятиуглеродных фрагментов, поэтому название этой группы веществ совпадает с их биохимической классификацией.

Классификация изопреноидов основана на количестве изопреновых единиц, входящих в состав молекулы. Соединения на основе только одной изопреновой единицы в растениях обнаружили лишь сравнительно недавно. Поэтому исторически сложилось, что монотерпенами назвали соединения, содержащие две изопреновые единицы и, следовательно, имеющие общую формулу (С5Н8)2, т.е. С10Н16. Изопреноиды, содержащие три изопреновые единицы, назвали сесквитерпенами, общая формула C15H24.Соответственно дитерпены построены из четырех, тритерпены - из шести и тетратерпены - из восьми пятиуглеродных фрагментов. Когда же обнаружили соединения, состоящие из одного и пяти изопреновых единиц, то их пришлось назвать соответственно гемитерпенами и сестертерпенами. Политерпеноиды каучук и гута имеют в своем составе от 100 до 5000 единиц изопрена.

Моно- и сесквитерпеноиды - как правило, легкоиспаряющиеся жидкости, часто с разнообразным запахом. Известно более 3000 этих соединений. Их классификация основана на наличии или отсутствии кольцевой структуры в молекуле, типе кольца, а также наличии и количестве двойных связей в молекуле. Моно- и сесквитерпены могут быть алифатическими (углеводород с незамкнутой цепочкой атомов), циклическими с различным количеством циклов (от одного до трех), а также содержать различные функциональные группы (гидрокси-, карбокси-, кето-группы). Они составляют основу эфирных масел. Моно-и сесквитерпеноиды часто обладают бактерицидным действием.

Дитерпеноиды также насчитывают несколько тысяч структур. Они являются главными компонентами смол у голосеменных (ель, сосна, пихта, кедр). Часто дитерпеноиды смол обладают бактерицидными свойствами.

Тритерпеноиды представлены несколькими группами соединений. Прежде всего это соединения первичного метаболизма - фитостерины, однако большинство тритерпеноидов являются типичными вторичными метаболитами. Тритерпеноиды обладают широким спектром биологической активности. К ним относятся сердечные, стероидные, тритерпеновые гликозиды, экдистероиды.

Тетратерпеноиды представлены в растениях главным образом каротиноидами, некоторые из них участвуют в основном обмене (фотосинтез), однако большинство (около 500) - это типично вторичные метаболиты.

Изопреноидные вторичные метаболиты, в отличие от алкалоидов, обычно после синтеза выводятся из клетки. Помимо клеточной стенки, они могут иногда накапливаться в вакуолях. Синтез изопреноидов может проходить в двух компартментах - в пластидах или в цитозоле. При этом существуют два независимых пути синтеза изопреноидов: мевалонатный - в цитоплазме, альтернативный - в пластидах. «Пластидный» синтез изопреноидов часто осуществляется в лейкопластах - специализированных «изопреноидных» пластидах, которые имеют ряд морфологических особенностей (например, отсутствие рибосом, особое расположение внутренних мембран). Для них характерны тесные контакты с ЭР («ретикулярный футляр»), что косвенно указывает на взаимодействие пластид и ЭР при синтезе изопреноидов.

Рис. 3. Структура некоторых сесквитерпеноидов и дитерпеноидов

Фенольные соединения - вещества ароматической природы, содержащие одну или несколько гидроксильных групп у ароматического кольца. Фенолами называют соединения с одним атомом гидроксила, полифенолами - с двумя и более. Многие фенольные соединения участвуют в основном обмене (в частности, в процессах фотосинтеза и дыхания), однако большинство из них - типичные представители вторичного метаболизма.

Фенольные соединения классифицируются в зависимости от числа ароматических колец и количества присоединенных к ним атомов углерода. Фенольные соединения принято разделять на три большие подгруппы: с одним и двумя ароматическими кольцами, а также полимерные фенольные соединения. Иногда в особую группу выделяют димерные фенольные соединения.

Отличительной чертой фенольных соединений является формирование огромного числа соединений за счет модификаций молекулы и образования конъюгатов с разнообразными структурами. Из модификаций для фенольных соединений характерны образование гликозидов, метилирование и метоксилирование. За счет гидроксильных и карбоксильных групп фенольные соединения могут связываться с сахарами, органическими кислотами, растительными аминами, алкалоидами. Помимо этого растительные фенолы могут соединяться с изопреноидами, образуя большую группу пренилированных фенолов. Такие свойства фенольных соединений обеспечивают огромное разнообразие структур, характерное для растительных фенолов.

Фенольные соединения накапливаются как в вакуолях, так и в периплазматическом пространстве. При этом в вакуолях обычно содержатся гликозилированные фенольные соединения, тогда как в периплазматическом пространстве - метаксилированные соединения или агликоны. Синтез фенольных соединений происходит в хлоропластах и цитозоле. Показано существование двух независимых путей синтеза ароматических соединений (шикиматные пути) - в цитозоле и в пластидах.

Многие соединения других классов вторичных метаболитов также накапливаются в вакуолях. Подобную локализацию имеют, например, цианогенные гликозиды, глюкозинолаты, беталаины.

Рис. 4. Фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами: стильбены (А), антрахиноны (Б), основные группы флавоноидов (В), антоцианидины (Г)

Минорные группы вторичных метаболитов

Растительные амины. В высших растениях присутствует большое количество аминов - первичных, вторичных, третичных и четвертичных. Многие из них структурно представляют собой декарбоксилированные аминокислоты, причем как белковые, так и небелковые. Растительные амины подразделяют на моноамины (с одной аминогруппой), диамины (с двумя аминогруппами) и полиамины.

Беталаины. Так называются водорастворимые азотсодержащие пигменты высших растений. Они присутствуют только в растениях порядка гвоздичные.

До сих пор не найдены растения, где две группы водорастворимых пигментов - антоцианы и беталаины - встречаются одновременно. Группу беталаинов составляют бетацианины и бетаксантины - соответственно красно-фиолетовые и желтые соединения. Бетацианины представляют собой гликозиды и ацилгликозиды всего двух агликонов.

Цианогенные гликозиды. Цианогенные гликозиды являются ?-гликозидами 2-гидроксинитрилов (цианогидринов). К настоящему времени в высших растениях обнаружено несколько десятков подобных соединений. Основные структурные вариации обусловлены природой заместителей R1 и R2. В качестве углеводного фрагмента как правило, выступает D-глюкоза. При гидролизе циано-генных гликозидов специфичной гликозидазой выделяется синильная кислота.

Небелковые аминокислоты. Под этим термином подразумеваются природные аминокислоты, их амиды, иминокислоты, которые в норме не входят в состав белков. Сейчас известно более 400 небелковых аминокислот. Многие из них можно рассматривать как модификации белковых. Наиболее часто встречаются варианты удлинения или сокращения углеродной цепи (добавление или удаление СН2- или СН3-фрагментов), гидрирование и дегидрирование, гидроксилирование, аминирование. Встречаются и необычные (например, селен-содержащие) аминокислоты. Небелковые аминокислоты преимущественно весьма токсичны, поскольку могут включаться в белки вместо «нормальных» аминокислот и нарушать их функции.

Необычные липиды. К ним относятся прежде всего «необычные» жирные кислоты, которые отличаются от «обычных» длиной углеродной цепи, иным расположением и количеством двойных связей, наличием дополнительных функциональных групп и циклов. Чаще всего необычные жирные кислоты обнаруживаются в масле семян. Во многих видах высших растений обнаружены соединения с одной или несколькими тройными связями. Такие соединения получили название ацетиленовых производных, или полиацетиленов. Известно несколько сотен таких структур. В отличие от необычных жирных кислот, ацетиленовые производные могут находиться во всех органах и частях растения. К необычным липидам относятся также цианолипиды, при гидролизе которых выделяется синильная кислота.

Серосодержащие вторичные метаболиты. К ним относятся прежде всего ти-огликозиды (S-гликозиды). Наиболее известны гликозиды горчичных масел (глюкозинолаты). Эти гликозиды характерны для растений семейства крестоцветных. Они обладают сильным антимикробным действием и обуславливают острый или жгучий вкус горчицы, хрена, редьки. Механизм действия глюкозинолатов весьма сходен с действием цианогенных гликозидов: после отщепления сахара мирозиназой образуются изотиоцианаты, обуславливающие жгучий вкус и раздражающее действие. Другую группу серосодержащих вторичных метаболитов составляют аллицины чеснока и лука, которые синтезируются из цистеина. Они также ответственны за жгучий вкус и антимикробные свойства этих растений.

1.6 Биохимия вторичного метаболизма

Пути биосинтеза вторичных метаболитов

Пути синтеза большинства вторичных метаболитов установлены достаточно хорошо. В настоящее время интенсивно изучается энзимология вторичного метаболизма. На основании имеющейся информации можно сформулировать некоторые закономерности биосинтеза этих соединений. Предшественниками синтеза служит относительно небольшое количество первичных метаболитов. Многие группы вторичных метаболитов могут синтезироваться несколькими путями. Часто этапы синтеза дублированы в разных компартментах клетки (например, пластиды - цитозоль). Синтез четко спланирован и обслуживается набором специальных ферментов, в большинстве случаев весьма специфичных.

Биосинтез алкалоидов. Образование этих веществ тесно связано с общим обменом азота клетки. Для большинства алкалоидов показано, что схемы их синтеза унифицированы, т. е. имеют сходную последовательность реакций. В процессе биосинтеза молекула аминокислоты практически полностью включается в структуру алкалоида. Синтез алкалоидов разных групп включает одинаковые типы реакций: декарбоксилирование, окислительное дезаминирование, альдольная конденсация, но для каждой группы алкалоидов эти реакции осуществляют «собственные» ферменты. На первом этапе синтеза происходит декарбоксилирование аминокислоты при участии соответствующей декарбоксилазы. Образовавшиеся биогенные амины подвергаются окислительному дезаминированию с участием аминооксидаз. Полученные в результате аминоальдегиды или аминокетоны в результате серии последовательных реакций образуют ключевые гетероциклические соединения. Затем происходит модификация базовой структуры с участием разнообразных реакций - гидроксилирования, метилирования и др. В формировании окончательной структуры алкалоида могут принимать участие дополнительные углеродные единицы, например ацетат (в виде ацетил-СоА) или монотерпеновая единица (для сложных индольных алкалоидов). В зависимости от сложности алкалоида его биосинтез включает от трех-четырех до десяти-пятнадцати реакций.

Для целого ряда алкалоидов не только установлена схема синтеза, но охарактеризованы и выделены ферменты. Оказалось, что некоторые ферменты синтеза не очень специфичны (в качестве субстратов могут использовать различные соединения), однако в цепочке синтеза обязательно присутствуют высокоспецифичные ферменты, которые используют только один субстрат (или ряд очень близких субстратов) и выполняют очень специфичную реакцию.

Например, при синтезе изохинолинов гидроксилирование базовой структуры по каждому положению выполняют разные ферменты. По мере продвижения к заключительным этапам синтеза сродство ферментов к субстрату обычно повышается: например, для ряда ферментов синтеза бербериновых алкалоидов Кт составляет менее 1 мкМ. В качестве примера на рис. 5 представлена схема синтеза изохинолиновых алкалоидов.

Рис. 5. Схема биосинтеза изохинолиновых алкалоидов

Биосинтез изопреноидов. Если при синтезе алкалоидов сходная цепочка превращений используется для различных исходных соединений (аминокислот), то синтез колоссального числа изопреноидов происходит из единственного предшественника - изопентенилдифосфата (ИПДФ). Под действием фермента изопентенилдифосфатизомеразы, которая сдвигает двойную связь, ИПДФ превращается в диметилаллилдифосфат (ДМАДФ). Далее ИПДФ присоединяется к ДМАДФ по двойной связи и образуется С10-соединение - геранилдифосфат.

Он служит источником всех монотерпеноидов.

Затем к геранилдифосфату присоединяется еще один ИПДФ и образуется С15-соединение фарнезилдифосфат - исходное вещество для синтеза сесквитерпеноидов. Далее фарнезилдифосфат может либо присоединить еще одну молекулу ИПДФ с образованием геранилгеранилдифосфата (С20-соединение - источник дитерпеноидов), либо димеризоваться с образованием сквалена (С30-соединение - исходное соединение для всех тритерпеноидов). Наконец, геранилгеранилдифосфат может димеризоваться с образованием фитоина - С40-соединения, источник тетратерпеноидов. Кроме того, к геранилгеранилдифосфату может последовательно присоединиться большое количество ИПДФ, формируя в конечном итоге полиизопреноиды - каучук и гуттаперчу. В результате описанных реакций образуется полный гомологический ряд С5-соединений разной длины. Далее эти алифатические молекулы могут «свернуться» в циклические структуры, причем количество циклов, их размер и типы сочленения могут быть самыми разными. На рис. 9.13 представлена общая схема синтеза изопреноидов.

Синтез базовых изопреноидных структур осуществляют всего два типа ферментов - пренилтрансферазы, которые «наращивают» длину изопреноидов, и циклазы, которые формируют соответствующий циклический скелет молекулы. При этом каждый тип структуры формирует специфическая циклаза. Так как типов циклических структур изопреноидов довольно много, то и количество циклаз должно быть внушительным. К настоящему времени их известно более ста. После формирования базовой структуры (или одновременно с этим), происходит ее модификация и «оснащение» функциональными группами.

Рис. 6. Общая схема биосинтеза изопреноидов (А) и два пути синтеза изопентенилдифосфата (Б) в растениях

Точками показаны меченые атомы в исходных соединениях и в образовавшихся ИПДФ.

Таким образом, биосинтез изопреноидов можно представить себе как своеобразный биохимический «моделист-конструктор». Вначале из унфицированых С5-модулей изготовляются гибкие линейные конструкции разной длины. Они представляют собой практически идеальный материал для «биохимического конструирования» и формирования множества вариантов циклических структур.

Растения используют оба варианта образования изопреноидов: в цитозоле синтез идет по классическому пути, а в пластидах - по альтернативному. При этом возможно не только дублирование синтеза изопреноидов в разных ком-партментах клетки, но и разделение по типу синтезируемых структур. Тритерпеноиды (включая стероиды) синтезируются в цитозоле из мевалоната, тогда как дитерпеноиды (включая фитол хлорофилла) и тетратерпеноиды (прежде всего каротиноиды) - в пластидах по альтернативному пути. Моно- и сесквитерпены, вероятно, могут образовываться разными вариантами в зависимости от структуры молекулы и вида растения.

Биосинтез фенольных соединений. К настоящему времени известно два пути образования фенольных соединений - шикиматный (через шикимовую кислоту) и ацетатно-малонатный. Основной путь шикиматный, это практически единственный способ формирования ароматического кольца. В качестве исходных соединений для синтеза выступают фосфоенолпируват (ФЕП) и эритрозо-4-фосфат. При их конденсации возникает семиуглеродная кислота (2-кето-3-дезокси-7-фосфоарабогептановая), которая затем циклизуется в 5-дегидрохин-ную кислоту. Из дегидрохинной кислоты образуется шикимовая кислота, которая имеет шестичленное кольцо, одну двойную связь, и ее легко перевести в соединения ароматического ряда. Из шикимовой кислоты возможно образование оксибензойных кислот - n-оксибензойной, протокатеховой, галловой. Однако основной путь использования шикимовой кислоты - образование через префеновую кислоту ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина. Фенилаланин (возможно, в ряде случаев и тирозин) - основной предшественник синтеза фенольных соединений. Дезаминирование фенилаланина осуществляет фермент фенилаланинаммиаклиаза (ФАЛ). В результате образуется коричная кислота, гидроксилирование которой приводит к образованию пара-кумаровой (оксикоричной) кислоты. После дополнительного гидроксилирования и последующего метилирования из нее образуются остальные оксикоричные кислоты.

Оксикоричные кислоты представляют центральное звено синтеза всех фенольных соединений клетки. Opтo-кумаровая кислота является предшественником кумаринов. После ряда реакций укорочения алифатической части молекулы образуются С6-С2- и С6-С1 - соединения - это второй путь образования оксибензойных кислот (первый - непосредственно из шикимовой кислоты). Оксикоричные кислоты могут образовывать различные конъюгаты, прежде всего с сахарами, однако основная масса оксикоричных кислот активируется путем взаимодействия с СоА. Два магистральных пути использования СоА-эфиров оксикоричных кислот - синтез лигнинов и синтез флавоноидов. Для синтеза лигнинов СоА-эфиры оксикоричных кислот восстанавливаются до спиртов, которые выступают в качестве мономеров синтеза. При синтезе флавоноидов СоА-производное оксикоричной кислоты взаимодействует с тремя молекулами малонил-СоА с образованием халкона. Реакцию катализирует фермент халконсинтаза. Образовавшийся халкон легко преобразуется в флаванон. Из флаванонов за счет реакций гидроксилирования, окисления - восстановления образуются другие группы флавоноидов. Затем может происходить модификация молекулы - гликозилирование, метоксилирование и др.

Ацетатно-малонатный путь синтеза фенольных соединений широко распространен у грибов, лишайников и микроорганизмов. У растений он является минорным. При синтезе соединений по этому пути ацетил-СоА карбоксилируется с образованием малонилацетил-СоА. Затем происходит каскад аналогичных реакций, в результате наращивается углеродная цепь и возникает поли-?-кетометиленовая цепочка. Циклизация поликетидной цепи приводит к образованию различных фенольных соединений. Таким способом синтезируются флороглюцин и его производные, некоторые антрахиноны. В структуре флавоноидов кольцо В формируется по шикиматному пути (из оксикоричной кислоты), тогда как кольцо А - по ацетатно-малонатному.

В клетке работают два шикиматных пути синтеза флавоноидов - один в пластидах, другой в цитозоле. В этих компартментах находится полный набор изоферментов шикиматного пути, а также ферментов фенольного метаболизма, в том числе ФАЛ и халконсинтазы. Таким образом, в растительной клетке существует две параллельные цепочки синтеза фенольных соединений (аналогично изопреноидам).

Синтез минорных классов вторичных соединений. Образование этих веществ также изучено достаточно полно. Для многих азотсодержащих соединений исходными веществами являются аминокислоты. Например, синтез цианогенных гликозидов начинается с декарбоксилирования соответствующей аминокислоты, затем последовательно формируются альдоксим, нитрил и ?-гидроксинитрил. На последнем этапе синтеза образуется цианогенный гликозид за счет гликозилирования ?-гидроксинитрила при помощи УДФ-глюкозы. Синтез обычно осуществляет комплекс ферментов: например, для дуррина этот комплекс состоит из четырех ферментов. Гены ферментов клонированы. Трансгенное по двум генам растение арабидопсиса приобрело способность к синтезу цианогенных гликозидов. Синтез беталаинов начинается от тирозина, который гидроксилируется и образуется диоксифенилаланин (ДОФА). ДОФА служит источником для двух фрагментов молекулы бетацианинов - беталамовой кислоты и цикло-ДОФА. Объединение этих двух соединений приводит к формированию бетацианинов. При синтезе бетаксантинов беталамовая кислота конденсируется с пролином. Серосодержащие вторичные метаболиты обычно синтезируются из серосодержащих аминокислот.

2. Методы исследования

Большое практическое применение имеет броматометрическое определение фенола. Определение фенола основано на том, что в анализируемый раствор вводится избыток бромат-бромидной смеси, которая в кислой среде выделяет свободный бром. Образующийся бром реагирует с фенолом:

С6Н5ОН + ЗВг2 С6Н2Вг3ОН + 3HBr

При добавлении к этому раствору иодида калия избыточный, не прореагировавший бром окисляет иодид до йода, который титруют стандартным раствором тиосульфата натрия:

Br2 + 2I = 2Br + I2+ 2S2O = 2I + S4O

Реактивы

Тиосульфат натрия 0,02 М раствор (или стандартизированный)*

Бромат-бромидная смесь.

Серная кислота 1М раствор

Крахмал, 0,5% раствор

Иодид калия, KI (к)

Колба мерная 500 мл

Колба коническая 250-300 мл

Мерный цилиндр 20 мл

Пипетки 20 и 25 мл

Бюретка 25 мл

Выполнение работы

Бромат-бромидный раствор можно приготовить по навеске: 0,334 г. KBrO3 и 1,2 KBr растворяют в дистиллированной воде и доводят до метки в мерной колбе вместимостью 500 мл, в этом случае концентрация приблизительно равна 0,024 М. Для получения такой же концентрации раствор можно приготовить из фиксанала KBrO3 - KBr 0,1 Н но в этом случае содержимое запаянной ампулы нужно растворить в 4 л дистиллированной воды.

Для анализа отбирают аликвоту (10 мл) раствора, содержащего 0,02-0,4 г/л фенола**, пипеткой в коническую колбу для титрования. Прибавляют 12 мл (пипеткой) бромат-бромидной смеси, 10 мл 1М раствора серной кислоты, закрывают пробкой и оставляют на 30 мин. Затем прибавляют 1 г иодида калия, взвешенного на технических весах, и снова закрывают пробкой. Через 5 мин титруют выделившийся йод раствором тиосульфата натрия, прибавляя в конце титрования, когда окраска раствора станет светло-желтой, 2-3 мл раствора крахмала. Титрование продолжают до исчезновения синей окраски раствора. Проводят три титрования и рассчитывают средний объем V1 из сходящихся результатов.

3. Практическое задание

К вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины.

2. Биосинтез белка происходит в рибосомах.

3. Фотосинтез происходит в листе, в клетках листа, в хлоропластах, которые содержат зеленый пигмент хлорофилл.

4. Единицей фотосинтеза является квантосома.

Анаэробная фаза дыхания - последовательность реакций, которая называется гликолиз.

В процессе гликолиза происходит преобразование молекулы гексозы до двух молекул пировиноградной кислоты:

С6Н12О6?2С3Н4О2 + 2H2.

Этот окислительный процесс может протекать в анаэробных условиях.

Заключение

В результате выполненной курсовой работы я узнала, что такое вторичные метаболиты, а также особенности вторичных метаболитов, к которым относятся: относительная низкая молекулярная масса (исключением являются, например, высокомолекулярные полиизопреноиды: каучук, гуттаперча, чикль); не обязательное присутствие в каждом организме (некоторые вторичные метаболиты широко распространены, так например многие фенилпропаноиды встречаются практически во всех растениях); как правило, являются биологически-активными веществами; синтезируются из первичных метаболитов.

Указанные признаки не являются обязательными, однако в совокупности достаточно чётко очерчивают круг вторичных метаболитов.

У растений вторичные метаболиты участвуют во взаимодействии растения с окружающей средой, защитных реакциях (например, яды). К ним относятся следующие классы: алкалоиды, изопреноиды, фенольные соединения, минорные соединения (насчитывают 10-12 групп, в частности: небелковые аминокислоты, биогенные амины, цианогенные гликозиды, гликозиды горчичных масел (изотиоцианаты), беталаины, цианолипиды, ацетогенины, ацетиленовые производные, аллицины, ацетофеноны, тиофены, необычные жирные кислоты, и пр.)

синтез фенольный алкалоиды биохимический

Список использованной литературы

1.«Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.

2.Лекарственное сырьё растительного и животного происхождения. Фармакогнозия: учебное пособие/под ред. Г.П.Яковлева. СПб.: СпецЛит, 2006. 845 с.

.Шабарова З. А., Богданов А. А., Золотухин А. С. Химические основы генетической инженерии. - М.: Изд-во МГУ, 2004, 224 с.

4.Чебышев Н.В., Гринева Г.Г., Кобзарь М.В., Гулянков С.И. Биология.М., 2000

Репетиторство

Нужна помощь по изучению какой-либы темы?

Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.